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热反应肉类香精反应底物—猪肉酶解物制备的研究
2012-7-6 10:36:33
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要: 本实验采用Papain、Flavourzyme、Neutrase和Protamex四种酶水解猪肉蛋白制备富含氨基酸、生物活性多肽的水解液。实验中确定了酶解前处理条件、各种酶的适宜添加量以及最合适的复合酶为Flavourzyme和Protamex。Flavourzyme 加酶量为18(LAPU/g蛋白),Protamex加酶量为0.045(AU/g蛋白)。复合酶酶解条件的优化采用响应面(RSM)法。最终确定复合酶的最佳作用条件:[S]=7.5%蛋白,T=49℃,起始pH=7.0,在优化条件下,时间为8小时时的DH=51.08%。
关键词:   猪肉蛋白    底物浓度    酶解    复合酶    响应面
 
Studies on preparation of reactant of thermal reaction  meat flavors
Abstract:  Pork protein was hydrolyzed with four kinds of commercial proteolytic enzymes (Flavourzyme, Neutrase, Papain and Protamex) in this paper. Firstly pretreatment condition and the optimum enzyme adding of each enzymes was obtained through one-level experiment. The optimum enzyme adding of Flavourzyme and Protamex were 18 (LAPU/g protein) and 0.045 (AU/g protein). Optimum hydrolysis conditions of mulriple enzymes were investigated with response surface method. The optimum concentration of substrate , temperature and initial pH were 7.5%, 49℃ and 7.0. Hydrolysis was carried out at optimum conditions for 8 hours, DH can reach 51.08%.
Key words:  pork protein   concentration of substate    enzymatic hydrolysis    mulriple enzymes   response surface method
 
 
0           前言
人类利用蛋白酶水解蛋白质生产食品和调味料已有悠久的历史,但直到1783年Spallanzani对胃消化的研究才拉开了人类研究蛋白质酶水解的序幕1。酶解法是一种新兴的动物蛋白水解液的生产方法。与已有的生产方法相比,酶解法有很多优点,因此对酶法生产动物蛋白水解液的研究很受重视。许多学者对蛋白酶及蛋白酶水解中的底物、反应速率、水解产物等方面作了大量的系统的研究。同时人们从酶解机理、酶解原料、酶及酶解液等方面也进行了大量的深入研究。
目前我国活性肽和蛋白水解物的研究主要集中在大豆蛋白、乳蛋白、鱼蛋白、牛肉蛋白等方面,其它类蛋白,尤其是对猪肉蛋白的研究几乎未见报道。随着国内养猪业迅速发展和人们生活水平的提高,天然保健食品正日益受到人们的青睐,猪肉蛋白水解物作为优质的营养保健基料,若加工成食品,必有可观的市场前景。
不同来源的蛋白质的氨基酸组成不同,特别是蛋白质中疏水性较强的氨基酸所占比例的不同,蛋白质的总体疏水性就会有所差异。Ney等人研究了肽和蛋白质的疏水性值与蛋白质酶水解产物口味的关系,当蛋白质的疏水性值较大时,该蛋白质用不含端肽酶的中性、碱性蛋白酶水解时就会产生较强的苦味,而疏水性值较小的蛋白质的酶水解产物的口感则较为平淡,而就同一种蛋白质而言,用不同来源的蛋白酶水解,其水解速率、水解程度以及水解产物的组成也会有所不同2。因此选择合适的蛋白酶,有利于提高蛋白质的水解效率和获得较理想风味的水解产物。
1           试验材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验原料与试剂
猪瘦肉  无锡市售。
木瓜蛋白酶200万u/g    广西南宁庞博生物工程有限公司生产。
Flavourzyme(风味酶)、Protamex和Nutrase1.5MG均为诺维信销售代理广州明远公司提供。
L-丝氨酸:生化试剂,上海人发综合利用厂。
1,4-二硫代苏糖醇:生化试剂,中国医药集团上海化学试剂公司。
其它试剂均为化学纯。
1.2 酶解原料的制备  
取猪肉100g,加入适量的水,与高速组织捣碎机中经10000r/min处理1min,然后根据试验的具体情况直接进行酶解或者经过适当的加热处理在进行酶解。
1.3 测定方法
1.3.1 蛋白质的测定:GB 5009.5-85。
1.3.2 水解度(DH)测定方法:OPA法[3~5]
1.3.3 氨基酸的测定
日立L-8800型氨基酸分析仪(华南农业大学测试中心)
1.4    统计分析[6~7]
实验所得数据皆采用SAS、MATLAB统计软件分析处理。
2           结果与讨论
2.1    酶解前猪肉液的预处理
酶解条件(Flavourzyme,风味酶):底物浓度 4.0%蛋白;T=50℃;加酶量 10LAPU/g蛋白;起始pH=7.0。
固定酶解条件,温度分别为65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃,对猪肉液进行热处理10min,以未经热处理的猪肉液为对照样,然后进行酶解,并记录DH,其试验结果如图1。


 


 

由图1可以看出,热处理,使得蛋白质分子发生一定的聚合,从而钝化了肉中本身的蛋白质水解,因而DH值低于对照样;但是,在实际的生产中,可根据酶解时间的不同,对猪肉液进行适当的热处理,以防止水解过程中的微生物污染。
2.2    单一酶加量的确定
2.2.1          实验安排及试验结果
以参考资料为依据,设定几个加酶量水平,其它酶解条件按理论条件设定,通过测定不同反应下的水解度,作水解度对加酶量曲线和水解度对时间曲线,可大致确定合适的加酶量,结果见表1,各种酶的特性见表2。
1 单因数试验确定的加酶量
酶类
Flavourzyme
Neutrase
Protamex
Papain
加酶量
18 LAPU/g蛋白
0.045AU/g蛋白
0.045AU/g蛋白
0.2万u/g蛋白
 
几种蛋白酶的特性8
酶类
作用特性
最适pH
最适温度()
标注活力
Flavourzyme
内+外肽酶
5.0~7.0
50
500LAPU/g
Protamex
内肽酶
5.5~7.5
35~60
1.5AU/g
Neutrase
内肽酶
5.5~7.5
45~55
1.5 AU/g
Papain
内肽酶
6.0~7.0
50~65
200万u/g
2.3    最佳复合酶的确定
Flavourzyme是一种由筛选的未经基因改造的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae)经深层发酵生产的蛋白酶/肽酶复合物,含有内切蛋白酶和外切蛋白酶两种活力。Flavourzyme可用于脱除低水解度 产物—苦味,也可用于彻底水解蛋白质,以增强风味。因此,由于Flavourzyme的这种特性,本实验把Flavourzyme选定为复合酶的一种。
以上述实验数据为依据,分别把Flavourzyme和其它三种酶复合,其它酶解条件为:pH=7.0,S=4.9%蛋白,T=50℃,进行酶解,并作DH-时间曲线,如图2所示。从图2可以看出,这三种复合酶的DH-时间曲线差别比较明显,其中Flavourzyme和Protamex组合DH-时间曲线变化较显著,因此Flavourzyme和Protamex组合较其它两个组合好,即Flavourzyme和Protamex组合的水解效果较好。
 
2.4    复合酶酶解最佳条件的确定
2.4.1  复合酶解试验安排及试验结果
根据有关文献资料,影响酶解的几个重要因素是温度、pH值、酶解时间、加酶量以及底物浓度。其中加酶量已由以上各种酶的单因素试验确定,所以这里只考虑温度、酶解时间、pH值和底物浓度四种因素对水解效果的影响。根据Flavourzyme和Protamex两种酶的特性,为考察这四个因素对酶水解速度、蛋白质水解度的协同影响,在此选用四因子的二次回归正交设计的组合试验方案,以水解度DH为优化指标,确定复合酶的最佳反应条件。酶解试验因素水平见表3,试验设计及结果如表4所示。
                         复合酶酶解试验因素水平表
      因素
因素水平
酶解温度(℃)
起始pH值
酶解时间(h)
底物浓度(%蛋白)
零水平
50
7.00
8
6.0
上水平
55
7.50
10
9.0
下水平
45
6.50
6
3.0
2.4.2  数学模型的建立及拟合
2.4.2.1  回归方程模型的建立及回归系数的求解
见表3所示,26个试验点,可分为三类:1~16,称为全面试验点;17~24,称为星号试验点;25~26,称为中心试验点。以水解度DH(%)为响应值,经回归拟合后,各试验因子对响应值的影响可用下列函数表示:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4++a11X12+a22X22+a33X32 +a44X42+a12X1X2+a13X1X3+a14X1X4+a23X2X3+a24X2X4+a34X3X4
四因子的二次回归正交设计的组合试验方案及试验结果
  因素
试验号
X1(温度)
X2(pH)
X3(时间(h))
X4(固液比)
水解度(%)
1
1
1
1
1
55.21
2
1
1
1
-1
58.66
3
1
1
-1
1
40.75
4
1
1
-1
-1
48.51
5
1
-1
1
1
54.88
6
1
-1
1
-1
48.49
7
1
-1
-1
1
40.40
8
1
-1
-1
-1
42.43
9
-1
1
1
1
52.89
10
-1
1
1
-1
55.46
11
-1
1
-1
1
29.09
12
-1
1
-1
-1
33.34
13
-1
-1
1
1
59.30
14
-1
-1
1
-1
51.52
15
-1
-1
-1
1
34.00
16
-1
-1
-1
-1
37.88
17
1.483
0
0
0
44.45
18
-1.483
0
0
0
48.74
19
0
1.483
0
0
39.42
20
0
-1.483
0
0
43.41
21
0
0
1.483
0
45.46
22
0
0
-1.483
0
29.80
23
0
0
0
1.483
32.63
24
0
0
0
-1.483
43.02
25
0
0
0
0
37.38
26
0
0
0
0
38.00
2.4.2.2  回归方程及回归系数的显著性检验
运用SAS RSREG程序对这26个试验点的响应值进行回归分析,分别得到表5、表6的回归方程系数及回归方程方差分析表。从表6中可以看出,用上述回归方程描述各因子与回归系数取值
系数
b0
b1
b2
b3
b4
a11
a22
a33
a44
a12
a13
a14
a23
a24
a34
取值
36.20
1.45
-0.04
7.51
-1.23
5.11
2.75
1.03
1.12
1.80
-2.48
-0.25
0.69
-1.64
1.63
响应值之间的关系时,其因变量与全体自变量之间的关系是显著的[F>ƒ0.01(14,11)],决定系
表6  回归方程的方差分析表
方差来源
自由度
平方和
均方
F值
R2
回归
14
1816.861
44.043
10.14
0.9281
总离差
11
140.762
12.797
 
 
数R2=0.9281,说明回归方程的拟合程度较好。表7回归方程各项的方差分析结果表明,方程一次项、二次项的影响都是高度显著的,交互项的影响也是显著的[F>ƒ0.01(4,14)],这说
 
表7  回归方程各项的方差分析表
方差来源
自由度
离差平方和
F
显著性
一次
4
1224.836
23.93
**
二次
4
347.178
6.78
**
交互项
6
244.848
3.19
注:**表示高度显著;*表示显著。
明所选的四个因素之间的交互效应较大,因此,可以用该方程代替试验真实点对试验结果进行分析。
2.4.3  四因素二次回归方程的优化(响应面分析)
2.4.3.1  交互效应
酶解温度、起始pH值、酶解时间和底物浓度每两因素之间对DH的影响在响应曲面和等高线上表现得更为直观。
由图3 可以看出,在选定的条件范围内,猪肉蛋白水解度较高值落在酶解温度和起始


 


 

图3  酶解温度和起始pH对DH的影响


 

 
 


 

图4  酶解温度和酶解时间对DH的影响
 
pH编码值的中间区域。随着酶解温度的变化,pH偏低或偏高,DH都下降;同样在合适的pH值下,酶解温度的偏低或偏高,DH也都下降。因此,pH最优化值对应的编码值是:0.0;而酶解温度优化值对应的编码值是:-0.2。
由图4可知,酶解时间没有优化值,且随着酶解温度的变化,酶解时间增加,DH值也随之增加;酶解时间减少,DH值也随之减少。即随着酶解时间的增加,DH值也随之增加。


 

由图5可知,酶解温度和底物浓度对DH的影响与酶解温度和起始pH对DH的影响类似,有一个DH较高的区域。底物浓度优化值对应的编码值为:0.5。
   经过SAS响应面分析,所得各因素的优化编码值以及其所对应的真实值之间的关系见


 


 

图5  酶解温度和底物浓度对DH的影响
   
表8;由于酶解时间的特殊性,其具体数值可以根据生产实际所需进行调整。
基于实验优化编码值与真实值之间的关系
因素
编码值
真实值
X1
-0.2
49℃
X2
0.0
7.00
X4
0.5
7.5%
    经试验,在优化条件下,水解猪肉蛋白8小时,水解度能达到51.08%,和理论预测值相符合。
2.4.3.2       因素的重要性-因子分析法
回归方程中各因素对指标DH的影响程度大小可由因子分析法来估计。其F值及F值检验见表9。
回归方程各因素F值及F值检验

因素
X1
X2
X3
X4
F Value
6.97
2.75
20.47
2.03
Pr >F
0.0036
0.0752
<0.0001
0.1525

由表9可以看出,在酶解温度、起始pH、酶解时间和底物浓度四因素的条件下,酶解时间对水解度的影响最大,其次是酶解温度,起始pH和底物浓度的影响最小。
2.4.3.3       水解液的氨基酸组成分析
利用日立L-8800型氨基酸分析仪对不同水解度下的水解液,进行游离氨基酸组成分析,其结果见表10。
10  游离氨基酸含量及水解度对应表

水解度(%)
15.82
30.47
42.03
游离氨基酸(mg•mL-1)
11.3
22.3
28.8

 
2.5                 
选用Flavourzyme和Protamex作为复合酶,水解猪肉蛋白,能得到较好风味的高水解度的水解液。本水解液可作为高富含氨基酸营养的基质,也可以作为热反应制备肉类香精的一种重要的基料,同时对呈味料的风味也具有重要的贡献。
 
 
[1].Jens Adler-Nissen, Enzymic Hydrolysis of Food P roteins Elsevier Applied Science Publishers, 1986
[2].Ney, K. H., Voraussage der Bitterkeit von Peptiden aus deren Aminosaure-zusammensetzing, Z. Lebensm-Umtcrsuch. Forsch, 1971(147), 64-71
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[8].孟祥河,张铁华等. 复合酶水解牛肉的研究. 食品科技,2002(2):17~20

   
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